🔬Cell stock 및 Cell thawing

 

 

모든 세포 실험의 기본이 되는 cell culture!

cell seeding 도 중요하지만, 건강한 세포 상태를 유지하는 것 또한 아주 중요한 요소입니다.✨

그렇기 때문에 실험 스케줄에 맞게 세포를 유지하고 사용하지 않을 때는 stock을 잡아서 불필요한

계대 배양을 줄여야해요!

 

1. Cell stock

🧪 실험 방법 (Protocol)

 

① 계대 배양 중인 cell plate를 trypsin 처리하여 세포를 떼어낸 후, centrifugation

👩🏻‍🎓 이 부분은 하단의 글에서 실험 방법에서 ⑥번까지의 과정을 참고하시면 좋을 것같아요!  

 https://mign0nj.tistory.com/entry/%F0%9F%94%AC-Cell-counting-Dye-based-Assay

🔬 Cell counting; Dye-based Assay

 

② 상층액 suction 후 freezing mixture 1ml 넣어주기

☝Tips 

  👩🏻‍🎓 Centrifugation 단계에서 바로 freezing mixture를 만들어 주셔야해요!

   ✔ freezing mixture의 경우 각 연구실의 스타일에 맞게 제조하시면 됩니다.

   ✔ complement media 500 μl + FBS 400μl + DMSO 100  μl 의 비율로 사용하고 있으나 고정 비율을 아니예요

    사용한 세포 상태에 따라 FBS의 비율을 줄이기도, 늘리기도 하는데 이또한 실험자의 선택이라는 점 참고하시면 됩니다.

   ✔ Cell stock을 여러개 잡는 경우라면, x stock 수만큼 만들면 되는데, 예로 들어볼께요

    10 % RPMI media를 사용하는 세포주가 3개라면 (세포주 구분없이 media만 같으면 됩니다.), 

   → complement media 2 ml + FBS 1.6 ml + DMSO 400  μl 총 4ml의 freezing mixture가 만들어지게 되고, 각 세포주의 pellet에 1ml 씩 넣어주면 되요! 

 

③ gently mixing 후 Cryovial에 옮겨 deep freezer로 이동

☝Tips 

  👩🏻‍🎓 cryovial에 표기해야 할 정보✨

    : 날짜, 세포주 이름, 사용 배지, 계대 배양 횟수, 사용자 이름

  ✔ Deep freezer에 오랫동안 보관하게 되면 세포 상태에 영향을 미칠 수 있으므로, 액체 질소로 이동해주어야 해요ꔛ

 

 

 👩🏻‍🎓DMSO의 역할!

 ① 동결 보호

 ✔얼음 결정 형성 방지: 세포를 동결할 때 물이 얼면서 얼음 결정이 생성되는데, 얼음 결정은 세포막을 손상 시켜 세포를 파괴할 수 이써요. 이때 DMSO는 물 분자 사이에 끼어들어 얼음 결정의 형성을 억제하여 세포 손상을 최소화 시켜줍니다

✔세포 생존율 향상:DMSO는 세포 내 수분 함량을 줄여 동결 주 세포 손상을 막고 세포 생존율을 높이는데 기여해요

  ② 용매

✔ DMSO는 극성이 강한 용매로, 다양한 물질을 용해할 수 있는데, 이는 세포 보관시 필요한 여러 물질을 녹여 세포에 전달하느데 도움을 주게 됩니다.

✔ 세포막을 통과하는 특성을 지녀 세포 내부로 빠르게 침투하여 보효 효과를 가지기도 해요!

 

하지만, 세포 독성이 있기 때문에, freezing miture를 pelllet에 넣었다면 최대한 빨리 진행하여 deep freezer에 보관하는 것이 좋아요!

2. Cell thawing

🧪 실험 방법 (Protocol)

 

① 세포를 풀기 전, water bath를 37 ℃ 맞춰놓기 

② 15 ml tube에 complement media 8 ml 넣어 놓기

③ 액체 질소에 보관 중인 cell stock을 꺼내어 water bath에서 녹이기

☝Tips 

  👩🏻‍🎓 이때, cell stock은 완전히 녹이기 보다는 살얼음? 정도의 상태에서 꺼내어 줍니다.

④ 1ml의 media를 파이펫 또는 파이펫 에이드를 이용하여 딴 후, cryovial의 세포와 섞은 후 (중화) 

   미리 덜어놓은 15 ml tube에 넣어준다 (tube의 총 volume은 10 ml)

⑤ centrifugation 후, pellet을 complement media로 풀어 준 후 plate/dish에 seeding 해준다

⑥ incubator로 이동

☝Tips 

  👩🏻‍🎓아침에 (~ 9AM) cell thawing을 진행 한 경우 저녁에 (6pm~) media change를 진행하여 cell 상태 확인!