🔬MTT assay

 

 

안녕하세요! 오늘 MTT assay에 대한 실험 방법 입니다

 

MTT assay는 살아있는 세포의 미토콘드리아에서 MTT에서 보라색의 formazan으로 환원되는 정도를 측정하는 방법으로, 세포 내 반응/formazan 용해/흡광도 측정 으로 이루어 집니다.

 

 

각 반응에 대해 간략히 소개해 드리자면,

 

① 세포 내 반응: 살아있는 세포의 미토콘드리아 내 탈수소 효소 (dehydrogenase)는 MTT를 보라색으로 불용성 formazan 결정으로 환원시켜요. 죽은 세포는 이러한 능력이 없구요!

② Formazan 용해: 생성된 formazan 결정을 DMSO 등의 유기용매로 용해

③ 흡광도 측정: 용해된 formazan 용액의 흡광도를 측정

 ✔ 흡광도는 살아있는 세포에 의해 환원되는 양을 의미해요

✔  흡광도가 높을수록 살아있는 세포 수가 많고, 낮을 수록 살아있는 세포 수가 적다는 의미입니다

 

---

[출처] biorender

🧪 실험 방법 (Protocol)

① Cell seeding 및 약물 처리 후 incubation

✔ 각 실험 조건에 맞춰 진행

 

② well에 있는 media를 조심스럽게 제거한 후 MTT 시약 (Working solution)을 200 μl씩 처리

☝ Tips 

  👩🏻‍🎓 연속성 있는 실험을 위해서는 다음 실험 과정을 파악하고 준비해주어야 하는데요!

         MTT 시약을 필요한 양에 맞게 미리 준비해주시면 됩니다 ꔛ

        ✔ MTT 시약 (Stock solution, 5 mg/ml MTT 시약 : PBS = 1 : 9)

        ✔ MTT 시약을 사용하는 모든 과정은 최대한 빛을 조심하는 것을 권장해요!

           (clean beanch의 빛도 조심!) 

👩🏻‍🎓 MTT 시약을 세포에 처리할 때 너무 세게 넣으면 세포가 손상되기 때문에 천천히 넣어주셔야 해요

 

☝ MTT 시약 (Stock solution) 만들기

  1. 5 mg/ml의 농도로 PBS에 녹이기

  2. sonication 25 min 후 0.2 μm filtering을 해준다.

  3. MTT 시약은 빛에 약하기 때문에 black tube 또는 호일에 감싸 냉장보관해준다.    

 

③ MTT 시약을 처리 후, incubation (37 ℃ with 5% CO2, 3-4 hours) 후 시약을 suction

☝ Tips 

  👩🏻‍🎓MTT 시약이 처리된 plate는 호일로 감싸주세요

       강한 suction은 권장드리지 않고 최대한 조심스럽게 suction해주시면 됩니다ꔛ

 

④ DMSO를 넣어 formazan 용해

☝ Tips 

  👩🏻‍🎓37℃, 1-2 분마다 가볍게 tapping해주며, adhension cell의 떨어졌는지 확인 (총 15 min)

  👩🏻‍🎓formazan (검은 침전물)을 이용하여 측정하는 것이기 때문에 formazan이 plate에 부착되어

   있지 않으면 microtuve에 옮긴 다음, cell down을 시키고 soup을 제거 후 DMSO를 넣어준다.

  

⑤ 흡광도 측정 및 결과 해석

☝ Tips 

  👩🏻‍🎓흡광도를 이용한 모든 실험에서는 control이 있어야 해요✨

    ✔ '약물에 대한 control = 약물을 녹인 용매를 처리한 세포' 라면,

        MTT 시약에 대한 control은 MTT 시약 only가 됩니다 ꔛ

        (empty well에 MTT 시약을 동량 넣어주면되고 이게 바로 backgroud 값이 됩니다!)

 

 

 ✨ 권장 사항은 아니지면, 실험을 하다보면 예기치 못한 일이 발생하는 경우가 있을텐데요!

    일주인간 실험이 날아가는 건 모두가 원치않잖아요,,, 그래서 꿀팁을 같이 공유해드리고자 합니다!  

      ✔ 실험 당일에 진행하지 못하는 경우

        → MTT 시약은 suction한 후, 호일로 감싸 RT에서 하루정도는 괜찮아요! 

            (실제로 실험해보면 결과값은 크게 달라지지 않습니다ꔛ )

      ✔ DMSO 처리를 바로 하지 못하는 경우 

        → DMSO 처리 후 37℃에서 15 min 반응시켜주는데요!

           시간적 여유가 되지 않는다면, DMSO를 넣은 plate를 호일로 감싸 shaker

           (최대한 낮은 RPM)에 올려기!

 

 

 

제가 실험 하면서 얻은 팁들을 더불어 정리해보았는데요!

관련하여 다른 팁들이 있다면 같이 공유해서 슬기로운 실험실 생활이 되었으면 합니다ꔛ

 

다음 글에서는 MTS / WST assay의 실험 방법을 소개해볼께요 ꔛෆ˙ᵕ˙ෆ