🔬 Cell counting; Dye-based Assay

 

 

지난 포스팅에서 Cell Viability를 확인할 수 있는 실험 방법들을 소개했었는데요.

이번 포스팅에서는 cell counting에 대한 실험 방법입니다.

 

Cell counting; Dye-based Assay는 세포 생존율을 측정하는 데 사용되는 실험 기법으로, 손상된 세포막을 가진 죽을 세포만이 trypan blue (파란색) 염료로 염색되는 원리를 이용합니다. 살아있는 세포는 온전한 세포막을 가지고 있어 trypan blue가 세포 내로 들어가지 못하므로 염색되지 않습니다. cell counting은 cell viability를 확인할 수 있을뿐 만 아니라 세포 배양 및 추후 진행되는 세포 실험에서도 중요한 역할을 하는데요. 실험을 보다 정확하게 수행하기 위해서는 사용하고자 하는 plate/dish에 적절한 cell 수로 culture하는 것이 실험 결과에 중요한 영향을 미치기 때문이예요! 

 

기본적인 실험 방법을 바탕으로 제가 실험하면서 얻은 팁을 같이 정리하였습니다ꔛ

 

[출처] biorender

 

🧪 실험 방법 (Protocol)

① flask/dish/plate의 culture media를 suction 한다.

 

② PBS를 충분히 넣어준 후 gently washing 및 suction 해준다.

 

③ 0.05 % Trypsin-EDTA solution 분주 후, incubation

   (37℃ , 1-2 분마다 가볍게 tapping해주며, adhension cell의 떨어졌는지 확인해준다)

☝ Tips 

  👩🏻‍🎓 보통 1X Trypsin-EDTA를 사용하지만, 세포가 온전히 떨어지는 시간이 5분 이상이라면

        2X Trypsin-EDTA를 넣어 cell culture를 진행하는 것을 추천

     ✔ Trypsin-EDTA를 오래 반응시켰을 때, cell에 damage가 있을 수 있기 때문!

     ✔ pipetting을 하게 되면 cell에 damage를 주는 경우가 있어 가급적 지양하고,

        한다면 serological aid로 진행 

 

④ complement media를 0.05 % Trypsin-EDTA solution의 3배 volume으로 넣어 중화

 Ex) 0.05 % Trypsin-EDTA solution 1ml을 넣어주었다면 complement media는

       3ml을 넣어준다 (총 4ml)

 

⑤ suspension cell을 conical tube에 옮겨준 후, centrifugation (800-1500 rpm, 3min)

☝Tips 

  👩🏻‍🎓 cell 마다 morphology가 다르기 때문에 구입한 cell datasheet를 확인하여

       cell culture에 적절한 조건 확인 

        ✔ 가벼운 cell의 경우 7-10 min centrifuge하는 경우도 존재

(이때, 다른 cell과 동일한 조건으로 3 min만 centrifuge를 한다면 cell confluence가 달라져요!)

 

⑥ pellet 확인 후 상층액을 suction해준다.

 

⑦ pellet을 complement media로 풀어준 후, cell 부유액  20 μl + trypan blue 20 μl 를 96 well/plate에 넣어준다 

☝Tips 

  👩🏻‍🎓 pellet을 complement media로 suspension 시켜줄 때, pellet을 꼭 확인해줍니다! media volume을 적지않은 이유는 배양하고 있는 flask/dish/plate가 다르고, cell 마다 크기가 달라서인데요.동일한 flask/dish/plate에 배양하더라도 크기가 작은 세포와 큰 세포가 있기 때문에 실험자가 배양하고 있는 cell 상태에 따라서 넣으시면 됩니다.

   ✔ auto cell counter가 없는 경우라면, 배지를 충분히 넣어 진행해주시면 수월하게 counting을 할 수 있습니다

   ✔ 다만, media를 너무 많이 넣게 되면 cell이 온전하게 counting되지 않을 수도 있으니 주의하세요!

 

⑧ pipetting 후 20 μl를 hemocytometer에 넣어준다 

 

⑨ 광학 현미경을 이용해 cell counting을 한다 

 

✔ hemocytometer의 구역 중 1-4 (굵은 직사각형 구역, 가장자리는 빨간색 표기 부분)만 cell counting을 진행

✔ cell counting 계산법 

  • '1+2+3+4' 구역에서 clear cell, blue cell을 각각 counting 해준다. 

  1) cell culture 진행 시,

    a. clear cell의 '1+2+3+4' cell 수를 더한 뒤, 평균값 (/4)을 구해준다

    → '1+2+3+4' cell 수: 340 이라면, 340/4 = 85

    → 희석배수를 곱해준다 (trypan blue와 섞어 cell counting을 했기때문,

                                           1:1로 2배 희석이기 때문에 x2)

         • 85 x 2=  170

    → cell count 결과: 170 x 10^4 cells/ml 

 

  2) Cell viability 진행 시

   a. clear cell: live cell, blue cell: dead cell이므로,

      'live cell count / (live cell count + dead cell count) x 100'가 cell viability가 된다.

   → live cell count: 256 / dead dell count: 133 인 경우

       256/(133+256) x 100= 65.809 %

  → 따라서, cell viability는 약 65.8% 이며, cell death는 약 34.2 % 가 된다  

 

 

제가 실험 하면서 얻은 팁들을 더불어 정리해보았는데요!

관련하여 다른 팁들이 있다면 같이 공유해서 슬기로운 실험실 생활이 되었으면 합니다ꔛ

 

다음 글에서는 cell death counting 정리하는 방법을 소개해볼께요 ꔛෆ˙ᵕ˙ෆ